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企業展示脂質體（liposome）是一種人工合成的、具有雙分子層結構的封閉囊泡，由磷脂、膽固醇、PEG等兩性分子自組裝形成。當兩性分子分散于水相時，疏水尾部聚集避開水相，親水頭部暴露在水相，形成獨特的囊泡結構。正是這種精巧的結構，賦予了脂質體藥物靶向遞送、降低毒性、提高穩定性、緩釋控釋等獨特優勢。
圖1 脂質體的結構
目前，中國已上市多種脂質體藥物，包括鹽酸多柔比星脂質體注射液、注射用紫杉醇、兩性霉素B脂質體、鹽酸伊立替康脂質體注射液、鹽酸米托蒽醌脂質體注射液等。隨著脂質體技術的不斷成熟，這類“復雜藥物制劑”的應用正在日益廣泛。
1 脂質體藥物體內存在形態：為何生物分析如此復雜？ 脂質體藥物進入機體后，并非以單一形態存在。至少存在三種形態：脂質體包裹的藥物、釋放出的游離藥物和釋放后與血漿蛋白結合的藥物。對于脂質體藥物進行藥代/毒代動力學的研究，需要細致探討不同形式藥物的濃度。 圖2 脂質體藥物體內存在形態 這背后的邏輯在于，在血液或正常組織內釋放的游離藥物濃度是與不良反應程度呈正相關，而在腫瘤組織等靶器官內釋放的游離藥物濃度則與藥效呈正相關。因此，準確測定不同形態的藥物濃度，是評價脂質體藥物藥效和毒性的關鍵。 更為復雜的是，脂質體的聚合物材料并非惰性物質。研究表明，聚合物材料可影響負載藥物的吸收、分布、代謝、排泄過程，甚至直接影響細胞色素P450酶的活性。聚乙二醇（PEG）作為脂質體的重要組成材料，還會顯著抑制P-糖蛋白的活性，長期使用可能導致腎蓄積毒性。 因此，準確定量不同形態的脂質體藥物以及載體中的主要成分，對于藥代動力學（PK）和毒代動力學（TK）評估至關重要。 2 法規要求：該測什么？ 對于脂質體藥物的生物分析，監管機構有著明確的要求。 FDA相關指導原則建議：對于脂質體新藥，檢測目標應為總藥與游離藥物；對于脂質體仿制藥，檢測目標應為游離藥物與脂質體包裹藥物。中國CDE于2023年發布的《脂質體藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》同樣強調，脂質體藥物在進入體內后，活性成分一般以負載型藥物（存在于載藥脂質體中未被釋放的藥物）和游離型藥物（從載藥脂質體中釋放至脂質體外的藥物）的形式存在，進行生物樣本分析時需要對二者進行有效分離。 3 分析策略：游離型藥物、負載型藥物與總藥 對于體內游離型或負載型藥物的測定，主要包括直接法與間接法兩種策略： 直接法：分別測定游離型藥物和負載型藥物，更能準確體現暴露量； 間接法：測定總藥物濃度和游離型藥物濃度，取二者差值即為負載型藥物濃度； 為保證測定的準確性，兩種方法在樣品處理和分離過程中，需確保負載型藥物、游離型藥物等不同形態成分的狀態不發生變化。 a)游離型藥物的分析 游離型藥物檢測的核心挑戰在于：脂質體在儲存及樣品處理過程中的穩定性。pH、溫度、共存化合物、滲透壓、凍融次數等因素均可能影響脂質體的穩定性。 目前最常用的方法是固相萃取法（SPE）。將含脂質體的血漿樣品上樣到SPE板后，游離藥物被保留在SPE填料上，隨后洗脫后進行LC-MS/MS分析。SPE法利用脂質體表面親水基團極性大、在SPE填料上無保留的特性，而游離藥物極性小、能夠保留在SPE填料上，從而實現有效分離。 b)負載型藥物的分析 負載型藥物的檢測同樣依賴SPE法。上樣后，由于脂質體表面的親水基團，脂質體整體穿過SPE填料。上樣時即刻收集通過的液體，經蛋白沉淀后進行LC-MS/MS分析，即可得到負載型藥物的濃度。 c)總藥的分析 總藥的分析相對直接。在高有機相或強酸強堿體系下，脂質體結構破碎釋放藥物，通過蛋白沉淀法可同時提取游離藥物和包裹型藥物，測得總藥物濃度。 圖3 脂質體藥物前處理 4 分離方法的選擇 傳統上分離游離型和負載型藥物較多使用平衡透析、超速離心、超濾和固相萃取（SPE）法，以上4種分析方法在《脂質體藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》的征求意見稿中均有包含；然而，正式稿僅保留了可以做直接法檢測的固相萃取法。 值得注意的是，親脂性和親水性藥物的分析策略有所不同。對于親脂性藥物，通?？梢允褂们笆鯯PE方式分離；但對于親水性藥物（如，阿糖胞苷、鉑類等），SPE無法通過極性區分游離型和負載型藥物，可能需采用其他方式，如，采用超濾法獲取游離藥物，再以離子交換SPE分離負載藥物。 實際應用中，可根據實驗目的不同，選用合適的方法進行分離檢測。下表總結了各方法的優劣勢： 5 生物分析方法建立的關鍵考量 a)穩定性：最核心的挑戰 脂質體藥物生物分析的最大挑戰，莫過于控制脂質體在樣品處理過程中的穩定性。若負載型藥物提前釋放，將嚴重干擾游離藥物的準確測定。 在早期探索性的非臨床研究中，可以在血漿樣品采集后立即處理的方式避免凍融；但臨床研究中樣品采集后往往需要運輸至生物分析實驗室檢測，同時也為了滿足生物分析法規對于ISR的要求，需要對血漿樣本中添加冷凍保護劑以防止儲存和處理過程中藥物的泄漏。常用的冷凍保護劑包括DMSO、甘油、某些聚合物、乙二醇、丙二醇、海藻糖和蔗糖等。冷凍保護劑的考察方式如下圖所示。 各穩定性實驗條件下，負載型藥物對游離型藥物檢測影響的考察方式，目前法規未有明確規定，但該穩定性考察策略是脂質體分析方法建立的重要和關鍵內容。 圖4 冷凍保護劑的作用原理和篩選方式 b)基質效應與回收率 由于脂質體給藥后樣本中既包含待測物又有制劑存在，需要特別關注空白脂質體的影響。如有可能，應在方法開發階段，采用含空白脂質體的血漿基質進行選擇性和基質效應的考察。 c)離心轉速的考量 血液樣品采集后需要離心獲得血漿，供后續的樣品分析。需要考察離心力對含脂質體的血液樣品分層和滲漏的影響，通過比較不同離心力下脂質體和游離藥物的峰面積差異，選擇合適的離心力進行血漿樣本制備。 此外，劇烈的渦旋可能導致脂質體滲漏，因此在樣品配制過程中應充分考慮脂質體制劑的性質。 d)載體材料的生物分析 《納米藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》和《脂質體藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》中都要求，當涉及新輔料/新載體材料 時，應研究新輔料/新載體材料的藥代動力學特征。 因此，若脂質體的載體材料中含有新組分，也需要納入生物分析范疇。聚乙二醇化脂質和陽離子脂質等材料均可通過蛋白沉淀或液液萃取進行提取。 脂質分子的溶解度和殘留問題在定量分析過程中需要特別關注，溶劑及流動相的選擇至關重要。目前有濟醫藥已有研究建立了生物基質中可電離脂質的LC-MS/MS定量方法。 6 案例分享 案例一：兩性霉素B脂質體——分析方法完整驗證，直接法檢測負載型藥物的實踐 有濟醫藥在兩性霉素B脂質體的非臨床研究中，建立了檢測總藥物、游離型藥物和負載型藥物的直接法和間接法生物分析方法。 在方法開發過程中篩選了合適的冷凍保護劑，重點優化了前處理條件、LC-MS/MS條件和穩定性控制策略，并對分析方法進行了完整驗證，用于檢測大鼠靜脈給藥后的血漿樣品分析。 通過比較直接法和間接法在負載型藥物檢測中的差異，結果顯示，兩種方法獲得的PK趨勢大致相當，但在消除相末端負載型藥物濃度較低時，間接法可能出現BQL（低于定量下限）結果，導致數據偏差。這一發現提示，在高靈敏度要求的PK研究中，直接法更具優勢。具體技術細節可參見我們2025年8月14日的直播內容（主題：脂質體藥物生物分析策略——直接法和間接法）。 案例二：阿霉素脂質體——穩定劑護航下的精準定量 以阿霉素脂質體為研究對象，有濟醫藥建立了LC-MS/MS方法檢測比格犬血漿中的游離型、負載型及總阿霉素進行定量分析。該研究將穩定劑添加到血漿樣本中，有效防止了儲存和處理過程中藥物的泄漏，為分析流程提供了靈活性。 案例三：四川藥檢的差異化策略——親脂/親水藥物的“量體裁衣” 四川省藥品檢驗研究院針對柔紅霉素-阿糖胞苷脂質體建立了差異化的生物分析策略： 親脂性柔紅霉素：采用反向吸附SPE——上樣時分離脂質體包封藥物，洗脫時分離游離藥物； 親水性阿糖胞苷：采用超濾法獲得游離藥物，采用離子交換SPE法在上樣時分離脂質體包封藥物； 總藥物：通過蛋白沉淀及破乳分離后進行液質聯用檢測。 這一策略的啟示在于：不同理化性質的藥物需要差異化的分離方案，單一方法難以覆蓋所有脂質體藥物類型。 7 結語 脂質體藥物憑借其靶向、降低毒性、提高穩定性、緩釋控釋等優勢，正在腫瘤、抗感染、鎮痛等多個治療領域發揮越來越重要的作用。然而，其特殊的體內存在形態和復雜的組成，給生物分析帶來了獨特的挑戰。 從游離型藥物、負載型藥物到總藥，從SPE到超濾，從冷凍保護劑的選擇到穩定性的方法驗證策略——每一個環節都需要精心設計和嚴格驗證。只有在方法建立過程中充分考慮脂質體的特殊性，才能獲得真實可靠的藥代動力學數據，為脂質體藥物的研發和申報提供堅實支撐。 隨著監管要求的日益明確和分析技術的不斷進步，脂質體藥物的生物分析正從“經驗驅動”走向“科學驅動”。這一領域的持續創新將為更多脂質體藥物的成功上市保駕護航，最終造福廣大患者。 有濟醫藥擁有完整的脂質體藥物生物分析平臺，在SPE法、超濾法等分離技術上積累了豐富的實戰經驗，已支持多個脂質體藥物的臨床前及臨床生物分析工作。無論是游離型藥物、負載型藥物還是聚乙二醇化脂質、陽離子脂質等新載體材料的定量分析，我們均可根據項目特點制定合理的分析策略，提供從方法開發到樣品分析的一站式解決方案。 參考文獻 [1] Artificial Cells, Nanomedicine, And Biotechnology, 2017 Doi:10.1080/21691401.2017.1290647 [2] Arzneimittelforschung, 2009;59(9):461–470 [3] Liposome Drug Products: Chemistry, Manufacturing, and Controls; Human Pharmacokinetics and Bioavailability; and Labeling Documentation, 2018, FDA [4] 脂質體藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則，2023，NMPA CDE [5] Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 12487; Doi: 10.3390/ijms232012487 [6] 脂質體藥物生物樣品分析的挑戰，2024，晶易醫藥 [7] 納米藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則（試行），2021，NMPA CDE [8] 四川藥檢：脂質體藥物檢驗檢測技術分享 [9] A convenient and rapid LC-MS/MS method for determination of free and liposomal amphotericin B in human plasma, 2025, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
