隨著小分子藥物、生物制品以及新型治療手段的快速發(fā)展，藥物在體內(nèi)的代謝過程日趨復(fù)雜。在藥物研發(fā)的非臨床階段，系統(tǒng)鑒定體內(nèi)外代謝產(chǎn)物是預(yù)測人體暴露風(fēng)險、指導(dǎo)毒理種屬選擇及優(yōu)化臨床試驗設(shè)計的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
根據(jù)ICH M3(R2)指導(dǎo)原則，若人體循環(huán)中某一代謝物的暴露量超過母體藥物總相關(guān)物質(zhì)AUC的10%（即MIST閾值），且其在人體中的暴露量水平顯著高于毒理學(xué)試驗動物中的最大暴露量，則表明所用動物種屬未能充分覆蓋該人體代謝物，此時需針對該代謝物另行開展非臨床安全性評價。美國FDA 2020年發(fā)布的《Safety Testing of Drug Metabolites》指導(dǎo)原則進一步強調(diào)，應(yīng)通過體外跨種屬比較驗證毒理種屬對關(guān)鍵代謝物的覆蓋能力。我國NMPA在《藥物代謝產(chǎn)物安全性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》中要求盡早進行代謝差異比較與分析，以決定是否開展安全性評價。為了更全面地理解藥物的代謝行為，通常需綜合運用多種實驗體系，對體內(nèi)外代謝產(chǎn)物進行定性與半定量分析。下文將系統(tǒng)介紹常用體外與體內(nèi)代謝實驗體系的特點及應(yīng)用策略。
體外代謝實驗體系是模擬藥物體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化過程的重要工具，可用于識別主要代謝產(chǎn)物及其代謝途徑。體系選擇需綜合考慮研究目的、藥物特性（如分子類型、理化性質(zhì)）及目標(biāo)代謝通路的覆蓋范圍。下文總結(jié)了常用體外代謝體系（按復(fù)雜性遞增：從簡單、機制明確到復(fù)雜、生理相關(guān)）及其特點與應(yīng)用策略。目的：明確特定代謝酶（如單個CYP450亞型、UGT、SULT等）對化合物的代謝作用。特點：表達(dá)單一特定的代謝酶（如CYP3A4、UGT1A1），體系純凈，背景干擾低，易于生成單一、純凈的代謝物。局限性：酶活性水平遠(yuǎn)高于生理濃度，缺乏體內(nèi)復(fù)雜的酶協(xié)同或競爭作用，結(jié)果外推至體內(nèi)需謹(jǐn)慎。
- 鑒定特定酶（如某個CYP或UGT亞型）介導(dǎo)的代謝途徑；
- 作為其他體系（如微粒體、肝細(xì)胞）代謝途徑研究的靶向驗證工具。
目的：評估化合物在對應(yīng)器官微粒體中的I相代謝穩(wěn)定性、代謝產(chǎn)物譜及主要參與代謝的CYP亞型等。特點：富含I相代謝酶（如細(xì)胞色素P450酶系）和部分II相代謝酶（如尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，UGT），應(yīng)用廣泛、標(biāo)準(zhǔn)化程度高、酶含量高、操作簡便和成本較低，適用于高通量篩選。局限性：缺乏完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，II相代謝酶含量較低（除UGT外），無法模擬藥物的完整攝取、轉(zhuǎn)運及分泌過程，可能低估結(jié)合型代謝物（如硫酸酯、谷胱甘肽結(jié)合物）的生成。
- 通常在單體酶確認(rèn)關(guān)鍵酶后，用于研究其在更接近生理的酶混合物環(huán)境中的代謝行為；
- 作為I相代謝（尤其是CYP450介導(dǎo)）研究的黃金標(biāo)準(zhǔn)和核心工具；
- 結(jié)合反應(yīng)（如葡萄糖醛酸化）的初步評價；
- 除肝微粒體外，亦可使用肺、腸、腎等器官來源的微粒體開展器官特異性代謝研究。
目的：評估包含I相（CYP450等）和II相（UGT、SULT、GST等）代謝酶在內(nèi)的更全面代謝穩(wěn)定性與代謝產(chǎn)物譜。特點：包含完整的I相和II相代謝酶（包括胞漿酶），可同時發(fā)生氧化、還原、水解和結(jié)合反應(yīng)，并可模擬溶酶體酸性環(huán)境，代謝潛力覆蓋更全面。局限性：酶濃度和活性通常低于微粒體或胞漿，背景雜質(zhì)較多，代謝速率較慢，難以大量生成代謝物。
- 當(dāng)懷疑有重要胞漿酶（如AO、XO、SULT、GST等）參與代謝或需同時考察I相和II相代謝時選用；
- 可快速獲得代謝物譜輪廓（尤其含II相結(jié)合產(chǎn)物）；
- 作為多肽-藥物偶聯(lián)物（PDC）和核酸類藥物代謝研究的初篩補充體系，用于評估水解酶介導(dǎo)的降解或酸性環(huán)境穩(wěn)定性，但需結(jié)合更生理相關(guān)的體系（如原代細(xì)胞、胞漿）進行關(guān)鍵機制驗證。
目的：評估化合物是否被特定胞漿酶代謝（如硫酸化、谷胱甘肽結(jié)合），研究相應(yīng)酶動力學(xué)。特點：主要含有可溶性II相代謝酶（如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，GST；N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶，NAT；硫酸基轉(zhuǎn)移酶，SULT；醛酮還原酶，AKR），無膜結(jié)構(gòu)干擾，酶活性位點直接暴露。局限性：完全缺乏I相代謝酶，僅覆蓋特定II相代謝途徑（如谷胱甘肽結(jié)合、硫酸化、乙酰化），代謝途徑單一，應(yīng)用場景受限。
- 專門研究特定II相代謝途徑（如SULT、GST等）或需可溶性輔因子的酶（如ALDH）；
- 生成特定II相代謝物標(biāo)準(zhǔn)品；補充微粒體或S9體系的研究結(jié)果。
目的：模擬藥物在完整、有活力細(xì)胞內(nèi)的整體代謝處置過程。特點：原代細(xì)胞（如原代肝細(xì)胞）保留完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，含豐富的I相和II相酶（如CYP、UGT、AO、FMO、SULT、GST等），具有最高的生理相關(guān)性。局限性：制備復(fù)雜，成本高昂，細(xì)胞活性隨時間下降較快。
- 引入了細(xì)胞完整性、轉(zhuǎn)運體、內(nèi)源性輔因子、酶的空間分布等更接近體內(nèi)環(huán)境的因素，是評估藥物整體代謝命運（攝取、代謝、外排）的金標(biāo)準(zhǔn)體系；
- 通常在亞細(xì)胞組分（微粒體/S9）篩選后，用于評估更綜合的代謝行為。
目的：通常用于研究化合物在組織（如腸、腎、肺、腦、皮膚）的代謝穩(wěn)定性與代謝產(chǎn)物譜，識別潛在的組織特異性毒性或活化。特點：保留了所有細(xì)胞器及酶系（包括I相和II相酶），最接近體內(nèi)的生理環(huán)境。局限性：背景干擾較大（含細(xì)胞碎片、內(nèi)源性物質(zhì)多），對分析技術(shù)要求較高，酶活性可能不如純化體系穩(wěn)定。
- 當(dāng)關(guān)注化合物在特定靶器官或首過代謝器官（如腸道）的局部代謝時使用；
- 核酸類藥物（如短干擾核糖核酸、小干擾RNA (siRNA)、反義寡核苷酸 (ASO)等）代謝研究常用體系（如肝、腎勻漿）。
腫瘤組織勻漿（Tumor Homogenates）目的：評估抗腫瘤藥物在目標(biāo)腫瘤組織中的代謝穩(wěn)定性（是否被腫瘤細(xì)胞快速滅活）或研究前藥在腫瘤組織中的活化特性（如通過腫瘤特異性酶的作用）。此外，研究腫瘤微環(huán)境（如酸性環(huán)境）對藥物代謝行為的影響。特點：直接針對靶組織，可能揭示腫瘤特異的代謝途徑（如某些腫瘤高表達(dá)的酶）。局限性：樣本獲取困難（通常來自手術(shù)或活檢）、個體差異大（腫瘤異質(zhì)性）、制備和標(biāo)準(zhǔn)化困難（勻漿程度、酶活性保持）。
- 識別和鑒定僅在腫瘤組織勻漿中出現(xiàn)或在腫瘤組織中顯著增強的代謝產(chǎn)物，從而發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤特異性代謝酶或通路；
- 驗證前藥是否能夠成功實現(xiàn)靶向活化策略的關(guān)鍵實驗。
血漿/全血（Plasma/Whole Blood）目的：評估化合物在血漿/全血中是否被酶解（如酯酶、肽酶）。特點：專門用于評估血漿/全血中水解酶（如酯酶CES、肽酶）介導(dǎo)的代謝行為。它能夠反映化合物在血漿/全血中的特異性失活途徑，操作簡單，并且無需添加輔酶因子。局限性：僅適用于評估水解代謝途徑，種屬差異顯著。例如，酯酶活性在動物與人類之間存在極大差異，因此臨床預(yù)測必須使用人源血漿/全血，而動物血漿僅適用于輔助機制研究。
- 驗證前藥的活化或穩(wěn)定性優(yōu)化，探索藥物在血漿中的活化與失活機理；
- 化合物在血液/血漿中的穩(wěn)定性研究及代謝產(chǎn)物快速篩選；
- 評估ADC、多肽類或寡核苷酸類藥物的降解風(fēng)險；
- 分析低生物利用度是否由血漿降解因素導(dǎo)致。
下表總結(jié)了不同分子類型推薦的體外代謝實驗體系、應(yīng)用策略及關(guān)鍵注意事項：
在早期研發(fā)階段，多采用上述體外體系進行跨物種代謝物譜對照，確認(rèn)所選物種可覆蓋人體代謝物。若發(fā)現(xiàn)動物中無或低量存在人特異性代謝物，則需重點關(guān)注該代謝物的毒性風(fēng)險。
在毒理學(xué)或藥代動力學(xué)研究過程中，收集血漿、尿液、糞便等樣本，通過LC-UV-HRMS等方法分析藥物及其代謝物譜。常用嚙齒類（小鼠、大鼠）和非嚙齒類（犬、靈長類）動物進行研究，通過不同物種的體內(nèi)代謝譜對比，可以初步判斷所選物種是否覆蓋人體代謝特征。
根據(jù)藥物研發(fā)的不同階段，應(yīng)合理組合使用上述實驗體系：
主要使用肝微粒體和懸浮肝細(xì)胞等體外體系快速評估候選化合物的代謝途徑。在此階段，常跨物種使用人、鼠、犬、猴的肝微粒體或肝細(xì)胞，篩選體外代謝產(chǎn)物并比較譜圖，初步識別代謝軟點，指導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化。若早期發(fā)現(xiàn)化合物代謝率慢或存在特殊代謝途徑，可使用更完善的體外體系進行深度分析。例如，對于慢速代謝物，可采用貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞或懸浮肝細(xì)胞接力孵育法以延長孵育時間；對于產(chǎn)生反應(yīng)性代謝物的化合物，可在微粒體/S9體系中加入GSH/Cys等捕獲劑，評估化合物的潛在毒性風(fēng)險。此外，可借助重組CYP/UGT酶體系鑒定具體酶亞型的代謝產(chǎn)物和貢獻(xiàn)度。在毒理學(xué)的動物種屬選擇時，進行跨物種體外代謝物譜對比和有限的動物體內(nèi)代謝研究，確保所選擇的物種可覆蓋人體代謝情況。代謝實驗體系的選擇應(yīng)以化合物結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)和已知代謝途徑為依據(jù)。對于疏水性較大、膜透過性較好的化合物，可優(yōu)先使用懸浮肝細(xì)胞測試；若預(yù)測主要通過CYP酶代謝，則首選肝微粒體；針對已知主要代謝酶，可使用重組酶進一步驗證其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。合理的實驗設(shè)計通常采取“由單一體系到多體系、先體外后體內(nèi)”的遞進式策略，以覆蓋盡可能多的代謝產(chǎn)物。不同物種之間的代謝酶譜存在顯著差異，導(dǎo)致代謝物譜在定性和定量上可能存在較大差異。例如，某些CYP亞型在人類、犬和鼠中的表達(dá)量不同，使得人特異代謝物僅在部分動物中出現(xiàn)（華法林在人體中由CYP2C9介導(dǎo)生成毒性代謝產(chǎn)物7-羥基華法林，在大鼠代謝研究中可檢測出該毒性代謝產(chǎn)物，而犬幾乎不產(chǎn)生7-羥基華法林）。因此，在選擇相關(guān)動物種屬時需充分考慮物種差異，通常建議在體外研究階段，采用人源及多種動物來源的肝細(xì)胞（或肝微粒體）進行平行評價，以提高體外至體內(nèi)外推的可靠性及毒理評估的物種相關(guān)性。根據(jù)FDA-MIST指導(dǎo)原則，當(dāng)人體血漿中發(fā)現(xiàn)高比例代謝物（>10%母體AUC）時，需與毒理動物的代謝物暴露進行對比。如果動物中缺少或暴露顯著低于人體的代謝物，則應(yīng)在該動物或其他替代物種中進行額外的代謝物安全性研究。國家藥監(jiān)局（NMPA）也鼓勵盡早開展人體放射性物質(zhì)平衡研究，以全面了解藥物的代謝和排泄特征。2024年發(fā)布的技術(shù)指導(dǎo)原則明確指出，通過人體物質(zhì)平衡研究可鑒定藥物在體循環(huán)中的代謝產(chǎn)物并測定其占比，為后續(xù)研發(fā)工作提供依據(jù)。因此，在開展非臨床研究時應(yīng)緊密結(jié)合全球法規(guī)要求，在合適的時間節(jié)點使用相應(yīng)體系獲得代謝物數(shù)據(jù)，以確保安全性評估的充分性。
非臨床階段藥物代謝產(chǎn)物研究需要綜合利用多種實驗體系，系統(tǒng)刻畫候選藥物的代謝命運。從體外肝微粒體、肝細(xì)胞、S9和重組酶體系到常規(guī)動物體內(nèi)代謝研究，各體系各有側(cè)重，應(yīng)根據(jù)藥物特性和開發(fā)階段合理組合使用。通過體外預(yù)測結(jié)合體內(nèi)驗證，實現(xiàn)代謝物的全譜分析和安全性評估，從而滿足藥物開發(fā)和監(jiān)管申報的需求。
在實際研究中，建議制定前瞻性的代謝研究策略，靈活調(diào)整實驗方案，確保關(guān)鍵代謝物在安全性研究物種和人體中得到充分覆蓋。有濟醫(yī)藥DMPK部門已建立完善的代謝產(chǎn)物研究平臺，使用LC-UV-HRMS（Q-Exactive或Q-TOF）高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀，在體內(nèi)/外生物樣品中捕獲未知代謝物信號響應(yīng)，結(jié)合專業(yè)數(shù)據(jù)分析解析軟件，快速完成結(jié)構(gòu)推測。同時，我們還搭建了放射性同位素技術(shù)平臺，可承接3H、14C 、125I、99mTc 等放射核素標(biāo)記物的非臨床與臨床相關(guān)研究，開展質(zhì)量平衡、物質(zhì)排泄途徑及代謝產(chǎn)物譜的定量與定性研究，全面揭示藥物在生物體內(nèi)的代謝命運。兩大技術(shù)平臺相互支撐，共同為藥物研發(fā)提供全面、可靠的代謝信息支持。
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