干細(xì)胞產(chǎn)品因其獨(dú)特的活細(xì)胞屬性和復(fù)雜的作用機(jī)制，在毒理學(xué)評(píng)價(jià)策略中與傳統(tǒng)化學(xué)藥物或生物制品有很大差異。關(guān)節(jié)腔給藥的干細(xì)胞產(chǎn)品在非臨床研究中面臨多維度技術(shù)挑戰(zhàn)，需結(jié)合關(guān)節(jié)腔解剖特性、細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)綜合考量，其中主要考量點(diǎn)包括：動(dòng)物的種屬選擇、劑量設(shè)計(jì)、特殊的檢測(cè)指標(biāo)、成瘤性和致瘤性等。

本文基于有濟(jì)醫(yī)藥既往研究經(jīng)驗(yàn)和對(duì)相關(guān)指導(dǎo)原則的解讀分析，系統(tǒng)梳理了關(guān)節(jié)腔給藥的干細(xì)胞產(chǎn)品的非臨床安全性評(píng)估思路和策略，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究者提供參考。

在國外，已有多款上市的關(guān)節(jié)腔給藥干細(xì)胞產(chǎn)品，例如：2009年Chondrocelect在歐洲獲批上市，是歐洲首個(gè)獲批的軟骨修復(fù)細(xì)胞治療藥物； 2012年Cartistem在韓國獲批，是全球首創(chuàng)的異基因干細(xì)胞藥物，用于植入治療關(guān)節(jié)軟骨缺損；StemOne是由印度藥物管制總局批準(zhǔn)的?膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（OA）?同種異體細(xì)胞療法。

在國內(nèi)，雖然還沒有關(guān)節(jié)腔給藥的干細(xì)胞產(chǎn)品正式上市，但已有一些產(chǎn)品處于臨床試驗(yàn)階段，有望填補(bǔ)該領(lǐng)域的空白。例如，西比曼生物科技的異體人源脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞注射液（AlloJoin?），是中國第一個(gè)獲批進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)的治療膝骨關(guān)節(jié)炎的干細(xì)胞藥物；上海愛薩爾生物科技有限公司治療膝骨關(guān)節(jié)炎的間充質(zhì)干細(xì)胞藥品也已進(jìn)入臨床III期，有望成為國內(nèi)首批商品化的關(guān)節(jié)給藥的間充質(zhì)干細(xì)胞藥物。

干細(xì)胞及其分化的功能細(xì)胞和/或其分泌的活性物質(zhì)、處方中非細(xì)胞成分等可能會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等產(chǎn)生影響。根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則的要求，在首次臨床試驗(yàn)前（IND階段），應(yīng)結(jié)合細(xì)胞產(chǎn)品的特性、細(xì)胞在體內(nèi)的分布特征評(píng)估是否存在安全性擔(dān)憂，決定是否進(jìn)行安全藥理學(xué)試驗(yàn)。

對(duì)于膝關(guān)節(jié)給藥，通常為充分考察干細(xì)胞藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等產(chǎn)生的影響，會(huì)考慮采用替代的給藥方式，如靜脈單次注射開展安全藥理試驗(yàn)。這種給藥方式不但可以考察干細(xì)胞在全身暴露情況下的藥理作用，還可以排除由關(guān)節(jié)腔給藥所引起的相關(guān)癥狀（如跛行等）對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)估的干擾。應(yīng)注意的是，需要結(jié)合供試品特性充分評(píng)估目標(biāo)產(chǎn)品是否適合靜脈注射，否則需要采用臨床擬用途徑。

2.一般毒理學(xué)試驗(yàn)

一般毒理學(xué)試驗(yàn)主要用于評(píng)價(jià)干細(xì)胞產(chǎn)品的系統(tǒng)毒性和局部毒性等。應(yīng)基于干細(xì)胞產(chǎn)品的生物學(xué)特性、可能的風(fēng)險(xiǎn)因素和安全性擔(dān)憂，采用基于風(fēng)險(xiǎn)、科學(xué)導(dǎo)向的思路設(shè)計(jì)方案。

對(duì)于膝關(guān)節(jié)給藥，為充分考察干細(xì)胞產(chǎn)品的毒性風(fēng)險(xiǎn)，在試驗(yàn)中的給藥方式，應(yīng)最大程度地模擬臨床擬用給藥方式，給藥頻率和試驗(yàn)期限應(yīng)能反映臨床使用情況。結(jié)合產(chǎn)品的預(yù)期存續(xù)特點(diǎn)和在動(dòng)物中的藥代動(dòng)力學(xué)特征設(shè)置合適的給藥次數(shù)、給藥頻率和試驗(yàn)期限，并確保試驗(yàn)中動(dòng)物暴露于受試物。

膝關(guān)節(jié)腔給藥的干細(xì)胞臨床通常單次用藥，或間隔1個(gè)月重復(fù)用藥1~2次，因此IND階段通常開展至少2周的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)，以滿足支持給藥期限不超過2周的臨床試驗(yàn)。通常情況下，即使擬定的臨床給藥期限不超過2周，委托方也會(huì)考慮直接開展4周或更長(zhǎng)周期的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)，盡可能滿足后續(xù)開展更長(zhǎng)的臨床試驗(yàn)或NDA的要求。

3.成瘤性和致瘤性試驗(yàn)

成瘤性試驗(yàn)主要用于評(píng)價(jià)動(dòng)物接種干細(xì)胞產(chǎn)品后，由接種的細(xì)胞自身形成腫瘤的可能性。致瘤性試驗(yàn)主要用于評(píng)價(jià)干細(xì)胞產(chǎn)品通過臨床擬用途徑給予動(dòng)物后，促使動(dòng)物的正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的可能性。在開展首次臨床試驗(yàn)前，應(yīng)基于干細(xì)胞產(chǎn)品的生物學(xué)特性、體外處理方式/程度、細(xì)胞存續(xù)特點(diǎn)、臨床擬用給藥途徑等因素，先初步評(píng)估干細(xì)胞產(chǎn)品的成瘤性和/或致瘤性風(fēng)險(xiǎn)，再確定評(píng)價(jià)策略。

對(duì)于成瘤性和致瘤性風(fēng)險(xiǎn)較低的成體干細(xì)胞產(chǎn)品（如未經(jīng)基因修飾的MSC），通常應(yīng)在IND階段至少完成體外成瘤性評(píng)價(jià)，如體外軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)、核型分析、端粒酶活性檢測(cè)等。

對(duì)于成瘤性和/或致瘤性風(fēng)險(xiǎn)較高的干細(xì)胞產(chǎn)品（例如多能干細(xì)胞產(chǎn)品、其他分化程度較低的干細(xì)胞產(chǎn)品、藥學(xué)和/或已有非臨床研究提示風(fēng)險(xiǎn)較高的產(chǎn)品等），應(yīng)完成體外和體內(nèi)成瘤性試驗(yàn)。若成瘤性試驗(yàn)出現(xiàn)陽性結(jié)果，或在一般毒理學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)動(dòng)物來源的癌前病變、可疑癌變時(shí)，還應(yīng)完成致瘤性試驗(yàn)。

對(duì)于擬用于非晚期腫瘤適應(yīng)癥且風(fēng)險(xiǎn)較低的干細(xì)胞產(chǎn)品，通常在NDA前完成體內(nèi)成瘤性和/或致瘤性試驗(yàn)。

對(duì)于膝關(guān)節(jié)給藥的干細(xì)胞產(chǎn)品，通常會(huì)參考《中國藥典》（第三部）的要求，成瘤性試驗(yàn)多采用皮下給藥的方式。根據(jù)最新發(fā)布的《人源性干細(xì)胞產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，致瘤性試驗(yàn)通常采用與臨床擬給藥途徑一致的給藥方式，即膝關(guān)節(jié)腔注射。

當(dāng)在動(dòng)物成瘤性和/或致瘤性試驗(yàn)中觀察到腫瘤發(fā)生時(shí)，需進(jìn)一步確認(rèn)腫瘤細(xì)胞的種屬來源，以明確其是來自于接種的干細(xì)胞產(chǎn)品還是來自于受者。目前非臨床評(píng)價(jià)中通常采用免疫組化的方法進(jìn)行腫瘤來源確認(rèn)。

4.遺傳毒性

常規(guī)非修飾的干細(xì)胞產(chǎn)品通常不需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)組合的遺傳毒性試驗(yàn)。

5.生殖毒性

對(duì)于關(guān)節(jié)腔給藥的干細(xì)胞產(chǎn)品，通常IND階段無需考慮進(jìn)行生殖毒性評(píng)估。因?yàn)橄リP(guān)節(jié)腔內(nèi)注射屬于局部給藥，干細(xì)胞主要滯留于關(guān)節(jié)腔，進(jìn)入全身循環(huán)的比例極低。若無證據(jù)表明干細(xì)胞或分泌因子進(jìn)入血液循環(huán)，生殖毒性風(fēng)險(xiǎn)可忽略。如果擔(dān)憂多次關(guān)節(jié)腔注射可能提升系統(tǒng)暴露概率，也可在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中關(guān)注生殖器官的病理學(xué)檢查結(jié)果（如睪丸/卵巢組織切片）。

6.制劑安全性

應(yīng)根據(jù)干細(xì)胞產(chǎn)品的特點(diǎn)與臨床應(yīng)用情況，開展終產(chǎn)品制劑的刺激性和溶血性試驗(yàn)。

關(guān)于毒理學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物種屬的選擇，應(yīng)基于干細(xì)胞產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)大小、相關(guān)動(dòng)物種屬/模型的可獲得性等因素綜合分析，總體目標(biāo)是盡可能最大程度地闡明干細(xì)胞產(chǎn)品的安全性特征，為人體安全性提供有價(jià)值的預(yù)測(cè)信息。在可行的情況下，盡量考慮獲得兩種相關(guān)動(dòng)物種屬的非臨床安全性信息。

選擇相關(guān)動(dòng)物時(shí)主要但不限于以下因素：

（1）動(dòng)物對(duì)人源干細(xì)胞及其分化后細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)與預(yù)期的人體反應(yīng)的相似性；

（2）動(dòng)物對(duì)人源干細(xì)胞的免疫耐受性；

（3）動(dòng)物的解剖學(xué)和病理生理學(xué)特征與擬定適應(yīng)癥人群的相似性；

（4）臨床擬用給藥途徑/給藥方式的可行性；

（5）涉及基因修飾的干細(xì)胞產(chǎn)品，還應(yīng)考慮動(dòng)物對(duì)目的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的敏感性、表達(dá)產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)。

在毒理試驗(yàn)之前，通常會(huì)開展關(guān)節(jié)內(nèi)給藥的藥效學(xué)研究，藥效學(xué)動(dòng)物模型可以為毒理試驗(yàn)的種屬選擇提供參考信息。根據(jù)文獻(xiàn)資料，目前關(guān)節(jié)腔給藥的干細(xì)胞產(chǎn)品在非臨床安全性評(píng)價(jià)研究中，常見的動(dòng)物種屬包括小鼠、大鼠、兔、猴和犬。

除以上五種常見的動(dòng)物種屬外，免疫缺陷動(dòng)物和疾病模型動(dòng)物也可以在一定條件下選擇使用。

免疫缺陷動(dòng)物：對(duì)于干細(xì)胞產(chǎn)品（尤其是異種來源），在免疫正常動(dòng)物中可能因宿主免疫排斥被快速清除，導(dǎo)致無法觀察其長(zhǎng)期存活、遷移、分化及潛在的異常增殖，如致瘤性。所以應(yīng)用免疫缺陷動(dòng)物可延長(zhǎng)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間，能夠更精準(zhǔn)地評(píng)估其在體內(nèi)的長(zhǎng)期生物學(xué)行為，這是致瘤性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。但免疫缺陷動(dòng)物無法替代免疫正常動(dòng)物評(píng)估免疫相關(guān)毒性。部分干細(xì)胞（如間充質(zhì)干細(xì)胞）具有免疫調(diào)節(jié)功能，如抑制 T 細(xì)胞活性，免疫缺陷動(dòng)物無法反映其對(duì)正常免疫系統(tǒng)的干擾。但是，免疫缺陷動(dòng)物尤其是重度缺陷模型，如 NOG 小鼠，對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)苛，需無菌隔離且價(jià)格昂貴，大規(guī)模試驗(yàn)的成本和操作難度明顯高于免疫正常動(dòng)物。

疾病模型動(dòng)物：對(duì)于膝關(guān)節(jié)給藥的干細(xì)胞產(chǎn)品，需結(jié)合產(chǎn)品的作用機(jī)制分析是否需要使用疾病模型動(dòng)物。例如，對(duì)于部分在體內(nèi)容易異常分化的干細(xì)胞，或有炎癥因子干擾，可以考慮使用疾病模型動(dòng)物。首先，疾病模型動(dòng)物可以模擬膝關(guān)節(jié)病理微環(huán)境，評(píng)估特異性風(fēng)險(xiǎn)；其次，可以揭示干細(xì)胞與病變組織的相互作用毒性，例如，滑膜炎癥分泌的 IL-6 可能會(huì)抑制干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能，甚至誘導(dǎo)其分泌促炎因子，加重局部炎癥。然而，目前動(dòng)物模型與人類疾病的病理情況還存在一定差異，例如種屬差異，動(dòng)物模型的軟骨退變速度遠(yuǎn)快于人類，需通過延長(zhǎng)試驗(yàn)周期來彌補(bǔ)；炎癥反應(yīng)差異，如嚙齒類動(dòng)物的滑膜炎癥以中性粒細(xì)胞浸潤為主，而人類骨關(guān)節(jié)炎以巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞為主，需通過基因編輯模型動(dòng)物（如 IL-1β 轉(zhuǎn)基因小鼠）優(yōu)化炎癥表型。

綜上所述，每種動(dòng)物種屬/模型均有其優(yōu)點(diǎn)和不足，沒有一種動(dòng)物種屬/模型可全面預(yù)測(cè)干細(xì)胞產(chǎn)品在患者人群中的有效性和安全性。因此，在選擇動(dòng)物種屬/模型時(shí)，應(yīng)評(píng)估所采用的動(dòng)物種屬/模型與人體的相關(guān)性和局限性。若有多種相關(guān)動(dòng)物種屬/模型，且這些動(dòng)物種屬/模型可提供互補(bǔ)的證據(jù)，建議采用多種動(dòng)物種屬/模型開展研究。

根據(jù)既往研究經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道，目前細(xì)胞產(chǎn)品治療關(guān)節(jié)疾病的藥效試驗(yàn)中最常采用的動(dòng)物種屬是大鼠和兔，因此大鼠和兔也成為后續(xù)毒理學(xué)評(píng)價(jià)（關(guān)節(jié)內(nèi)給藥試驗(yàn)）中優(yōu)先選用的相關(guān)動(dòng)物種屬。考慮到細(xì)胞產(chǎn)品在動(dòng)物體內(nèi)的存活時(shí)間，對(duì)于細(xì)胞產(chǎn)品的體內(nèi)成瘤性和致瘤性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估則多采用免疫缺陷小鼠或大鼠。

2.劑量設(shè)計(jì)

2.1安全藥理

安全藥理學(xué)試驗(yàn)主要對(duì)所觀察到的不良反應(yīng)的劑量反應(yīng)關(guān)系進(jìn)行研究，因此，藥效學(xué)劑量或人擬用的有效劑量是劑量設(shè)計(jì)重要的參考。一般情況下，低劑量應(yīng)包括或超過藥效學(xué)有效劑量或治療范圍，高劑量會(huì)參考重復(fù)給藥試驗(yàn)中產(chǎn)生毒性反應(yīng)的最低劑量。由于受到干細(xì)胞產(chǎn)品的細(xì)胞濃度的影響，劑量間距通常有限，因此可設(shè)置兩個(gè)劑量組進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2一般毒理學(xué)

通常情況下，一般毒理學(xué)試驗(yàn)應(yīng)保持合適的劑量間距，有助于評(píng)估毒性反應(yīng)-劑量關(guān)系的陡峭程度和 I 期臨床劑量遞增方案的設(shè)計(jì)。高劑量一般期望獲得明顯毒性反應(yīng)的相關(guān)信息，通常為藥效學(xué)最高劑量的一定倍數(shù)或擬推薦臨床最高劑量的一定倍數(shù)。關(guān)節(jié)腔給藥的最高劑量設(shè)置會(huì)受到動(dòng)物關(guān)節(jié)腔容量/大小和制劑最高濃度的限制，通常選擇最大可行劑量。低劑量的設(shè)置可參考藥效學(xué)起效劑量或臨床擬用劑量，在保證一定倍數(shù)的情況下，確保至少在低劑量下可以獲得NOAEL劑量。由于劑量間距有限，一般毒理學(xué)試驗(yàn)也可設(shè)置兩個(gè)劑量組進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3成瘤性和致瘤性

高劑量組給藥部位：關(guān)節(jié)囊炎癥

試驗(yàn)項(xiàng)目：兔重復(fù)毒性試驗(yàn)

動(dòng)物種屬：新西蘭兔

供試品：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

給藥方式：雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔給藥，200 μL/側(cè)，Q2W，給藥4周，恢復(fù)4周

試驗(yàn)結(jié)果：

（1）臨檢：高劑量組雌雄動(dòng)物NEUT、MONO、EOS絕對(duì)計(jì)數(shù)及比例升高。

（2）組織病理學(xué)：給藥期結(jié)束，高劑量組動(dòng)物給藥部位可見關(guān)節(jié)囊炎癥，停藥后有恢復(fù)趨勢(shì)。

（3）主要毒性反應(yīng)：僅局限于給藥局部組織刺激性和相關(guān)炎癥細(xì)胞變化。

高劑量組給藥部位：關(guān)節(jié)囊炎癥

試驗(yàn)項(xiàng)目：成瘤試驗(yàn)

試驗(yàn)體系：NPG小鼠

供試品：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

給藥方式：單次皮下注射

試驗(yàn)結(jié)果

（1）試驗(yàn)體系：陽性對(duì)照組全部動(dòng)物給藥部位Hela細(xì)胞瘤均呈進(jìn)行性生長(zhǎng)；陰性對(duì)照組動(dòng)物未見腫瘤形成或轉(zhuǎn)移，說明本試驗(yàn)體系建立成功。

（2）組織病理學(xué)：僅陽性對(duì)照組給藥部位可見Hela細(xì)胞瘤；陰性對(duì)照和供試品各劑量組動(dòng)物均未見腫瘤形成和轉(zhuǎn)移。

結(jié)論：供試品在體內(nèi)無成瘤性風(fēng)險(xiǎn)。

高劑量組給藥部位：未見腫瘤形成

高劑量組肺臟：未見腫瘤形成